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凝集素
從動(dòng)植物中提純的糖蛋白
簡(jiǎn)介
凝集素是動(dòng)物細胞和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結木菠蘿凝集素合的蛋白質(zhì),在細胞識別和粘著(zhù)反應中起重要作用,主要是促進(jìn)細胞間的粘著(zhù)。凝集素具有一個(gè)以上同糖結合的位點(diǎn)，因此能夠參與細胞的識別和粘著(zhù),將不同的細胞聯(lián)系起來(lái)。
其常見(jiàn)種類(lèi)見(jiàn)表6-1。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它們的總稱(chēng)。凝集素不是來(lái)源或參與免疫反應的產(chǎn)物，凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法所應用。因此，Ponder（1983）提出應稱(chēng)“凝集素組織化學(xué)”而不能稱(chēng)為“凝集素免疫組織化學(xué)”。
雖然人們認為在植物中凝集素的功能是結合細胞表面上的糖蛋白，然而在動(dòng)物中它的功能也包括結合可溶性的細胞外或細胞內糖蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，有一種凝集素被發(fā)現在哺乳類(lèi)動(dòng)物肝細胞的表面上，能夠專(zhuān)一性的識別乳糖殘基。人們相信這些細胞表面上的接受器是負責將循環(huán)系統中的特定糖蛋白移除。另一個(gè)例子是甘露糖-6-磷酸接受器能夠識別含有此種殘基的水解酵素，隨后標定這些蛋白將其送至溶小體。它們提供許多不同的生物功能——從細胞附著(zhù)的調控，到糖蛋白合成，以及血液中蛋白質(zhì)的濃度。凝集素也能夠借由識別僅在病原中發(fā)現或是無(wú)法進(jìn)入宿主細胞的的糖類(lèi)而在免疫系統中扮演重要的角色。
植物凝集素
植物凝集素是來(lái)源于植物的一類(lèi)能凝集細胞和沉淀單糖或多糖復合物的非免疫來(lái)源的非酶蛋白質(zhì)。由于其對于單糖或糖復合物特異性結合的能力，使得其在如信號轉導、免疫反應、植物防御等諸多信號過(guò)程中均具有重要作用。同時(shí)植物凝集素具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學(xué)、醫學(xué)及農業(yè)方面均有較好的研究?jì)r(jià)值和應用前景。
凝集素是指非免疫來(lái)源的糖結合蛋白或糖蛋白，并應有使細胞凝集或糖復合物沉淀的能力。此定義包含三個(gè)要點(diǎn)：(1)凝集素是蛋白質(zhì)或糖蛋白；(2) 凝集素必須有專(zhuān)一的與糖基結合的特性，但是排除了免疫來(lái)源的針對糖基的抗體；(3) 因為規定了能使細胞凝集或是糖復合物沉淀的特性，所以凝集素分子必須具有兩個(gè)或更多糖結合位點(diǎn)，這樣把一些雖有糖結合能力但是糖結合位點(diǎn)僅有一個(gè)的酶、轉運蛋白、激素、毒素等排除在外。凝集素可以識別糖蛋白和糖脂中復雜的碳水化合物結構，也識別細胞膜表面的糖基，因此，凝集素可以作為研究細胞膜結構的有利工具。此外，凝集素由于具有多價(jià)結合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結合而不影響其生物活性，因此，凝集素也可用于免疫細胞化學(xué)的研究，以及腫瘤的診斷評價(jià)等。凝集素蛋白至少包含一個(gè)可以結合碳水化合物的結構域，基于此，凝集素可以被分成主要的四類(lèi)，部分凝集素(merolectins)、全凝集素 (hololectins)、超凝集素 (superlectin)以及嵌合凝集素 (chimerolectins)。
純化的凝集素對于臨床應用非常重要，因為它能夠用來(lái)鑒定血型。有些存在人類(lèi)紅血球上的糖脂質(zhì)以及糖蛋白能夠經(jīng)通過(guò)凝集素來(lái)鑒定。一種來(lái)自于雙花扁豆（Dolichos biflorus）的凝集素，經(jīng)鑒定后發(fā)現可識別A1血型。來(lái)自于植物Ulex europaeus（重瓣刺金雀/荊豆/烏樂(lè )樹(shù)）的凝集素，經(jīng)鑒定后發(fā)現可識別H血型抗原，而來(lái)自于植物Vicia gramineae（野豌豆屬禾本科）的凝集素則可識別N血型抗原。
凝集素在植物中的真正功能還有待研究，而是否僅具細胞附著(zhù)功能依然還有疑問(wèn)。凝集素在種子中大量表現（通常自種子中純化），并且隨著(zhù)植物生長(cháng)而減少，這顯示其在植物發(fā)芽或種子自我生存中扮演了重要角色。
凝集素被視為免疫系統中的直接演化前身，而且它們至今依然在此扮演重要角色 - 凝集素補體激活途徑、甘露糖結合凝集素、S、P、E凝集素,等等。
豆科植物中的凝集素已被廣泛的作為模式生物來(lái)了解蛋白質(zhì)如何識別糖類(lèi)的分子基礎，因為它們相對容易取得而且具有廣泛的糖類(lèi)種類(lèi)。許多凝集素的晶體結構也揭示了糖類(lèi)與蛋白質(zhì)之間的原子作用。
應用
一般認為細胞膜上特定的糖基可用以區別細胞的類(lèi)型和反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細胞結合凝集素的性能可以預先估計，如雙花扁豆素之于血型A物質(zhì)的特異性，荊豆凝集素之于血型O物質(zhì)2—L—巖藻糖的特異性，然而在絕大多數情況下，關(guān)于由凝集素所識別的碳水化合物決定簇的種類(lèi)，關(guān)于攜帶決定簇的分子的性質(zhì)和機能，完全憑實(shí)驗經(jīng)驗去發(fā)現。
細胞分化標志：
作為細胞分化和成熟的標記 應用凝集素作為細胞分化的標志，在這方面的應用報告最多，而且研究比較集中于血細胞，特別是淋巴細胞的分群。如Rose（1980）等發(fā)現在小鼠胸腺皮質(zhì)內不成熟的T淋巴細胞呈PNA陽(yáng)性反應，在小鼠小腸集合淋巴小結的生發(fā)中心也發(fā)現有20%左右的PNA陽(yáng)性反應細胞，后者是否屬于不成熟的T淋巴細胞，是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。Newman等（1979）以熒光素標記凝集素PNA，發(fā)現在大鼠乳腺上皮的不同分化時(shí)期顯示不同的熒光強度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細胞，熒光弱或無(wú)，隨著(zhù)性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強，而泌乳期熒光強度達最高峰。在皮膚角質(zhì)細胞自基底向表層分化、成熟的過(guò)程中，細胞表面的碳水化合物的分布和性質(zhì)都在改變。Brabed等（1981）應用新生大鼠皮膚的實(shí)驗表明，皮膚各層細胞分別與不同的凝集素相結合。麥芽素與角質(zhì)化細胞相結合，蓖麻素與棘細胞和基底細胞相結合，而荊豆凝集素標記在棘細胞的表面。在成肌細胞（myeoblast）的分化與成熟過(guò)程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到類(lèi)似的皮膚的改變。
細胞特殊類(lèi)型標記：
凝集素
管內皮細胞上，電鏡觀(guān)察顯示DBA結合在內皮細胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內皮細胞顯示肯定的DBA陰性反應，說(shuō)明同一種屬動(dòng)物的血管內皮細胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987）發(fā)現Griffonia Simplicifolia凝集素特異性標記面神經(jīng)節內的小膠質(zhì)細胞，其它類(lèi)型的膠質(zhì)細胞如星狀膠質(zhì)細胞（astrocyte）等都顯示陰性反應。在切斷面神經(jīng)后，增殖的小膠質(zhì)細胞對Griffonia Simplicifolia凝集素的反應加強，免疫電鏡觀(guān)察表明，凝集素主要沉積在細胞膜或小膠質(zhì)細胞突起的軸膜表面，特異性結合糖基是α—D—半乳糖。上海醫科大學(xué)附屬腫瘤醫院免疫病理室應用12種凝集素（表6-1）對人胚胎及各種正常組織進(jìn)行了系統的凝集素受體的定位研究，結果表明，凝集素受體的分布并無(wú)即定規律可尋。如胃粘膜主細胞為PNA受體，而壁細胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA）主要出現在大腸部份。
伴有細胞膜的改變：
在腫瘤中凝集素結合的改變 腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會(huì )產(chǎn)生相應的變化，可用凝集素檢測出來(lái)。大量研究發(fā)現，凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標志、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。如張華忠等（1987）報道115例胃癌標記PHA陽(yáng)性率高達90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認為PHA是胃癌的診斷性標志。BSA對乳腺惡性腫瘤陽(yáng)性率達79%，而對良性病變均呈陰性反應，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關(guān)標志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類(lèi)型，如神經(jīng)系統星形細胞瘤ConA陽(yáng)性，小膠質(zhì)細胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細胞癌陽(yáng)性。
化學(xué)應用
凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標記，分別進(jìn)行下列染色法：
直接法
標記物直接標記在凝集素上，使之直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結合。
（1）切片脫蠟至水。
（2）凝集素標記物（100μg/ml），室溫，30min。
（3）TBS洗3次，每次2min。
（4）如為熒光素標記物，封片用熒光顯微鏡觀(guān)察。如為酶標記物，則應依次進(jìn)行呈色、脫水、透明和封固后在光學(xué)顯微下觀(guān)察。
直接法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。
間接法
凝集素受體表達
抗體上。
（1）脫蠟至水。
（3）凝集素稀釋液（100μg/ml）孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次2min。
（5）用標記了的抗凝集素抗體（1：100）孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次2min。
（7）呈色、脫水、透明、封片。
（8）觀(guān)察。
間接法染色還可進(jìn)一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著(zhù)用抗凝集素抗體孵育，再用標記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進(jìn)一步提高其敏感性，PAP復合物也可作為標記物標記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標記物與之結合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購買(mǎi)或自制抗凝集素抗體。
糖—凝集素—糖法：
本法是利用過(guò)量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結合部位，將這些部位與有過(guò)氧化物酶標記的特異性糖基相結合，形成一個(gè)三明治樣的糖—凝集素—糖的結合物。
（1）脫蠟至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內源性過(guò)氧化物酶10min。
（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次3min。
（6）TBS洗3次，每次3min。
（7）DAB呈色、脫水、透明、封固。
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